J Exp Med：烟酰胺单核苷酸转移酶（NNT）通过维持Fe-S蛋白功能而调节NSCLC磷酸化代谢

人类癌症体现单单极强大而适合于的叶绿体降解，似乎是由肺的组织的高氨持续性造成的。由于活持续性氨(ROS)的转化是这种降解的甲苯，因此只能以烟乙基胺腺嘌呤二碱基腺苷(NADPH)的基本概念来增大氨可不激，以可不对这种叶绿体活持续性的弱化。烟乙基胺单碱基转移蛋白酶(NNT)可通过NADPH的转化来可维持叶绿体的抗氨并能，但其在非小巨噬细胞癌症(NSCLC)中的的主导作用已经说明。本研究者发掘单单NNT的表达单单来在癌症血清数学方法中的显著弱化了癌巨噬细胞的呈现单单和摧残持续性。另内外，更进一步研究者发掘单单NNT紊乱亦会造成了叶绿体机制障碍，这与氨可不激的大量增高相关联，而是以Ag抗原的活持续性增大为图案。这些理由与NADPH的有效持续性和ROS的积攒有关，这得出结论NNT在减轻这些最重要抗原辅因子的氨中的起着最重要主导作用。

实验设计

许多常见的癌症血清数学方法是运用C57BL6/J血清的饲养战略而建立。古怪的是，这些血清载运纯合内外显子7-11的左上角紊乱以及叶绿体中的Nnt基因序列的错义持续性状造成了非机制抗原的表达单单来。因此，可以运用这种自然物理现象紊乱的表型(NntΔex7-11)来评分NNT对癌症暴发的冲击。

首先，使用Kras持续性状(LSL-KrasG12D/+)引致的癌症数学方法来检查Nnt表达单单来对癌症暴发的冲击。载运Cre重新组建蛋白酶的腺免疫缺陷LSL-KrasG12D/+血清，可诱发KrasG12D在肺上皮中的的表达单单来和肺癌的呈现单单。运用LSL-KrasG12D/+血清和C57BL6/J血清交配造成了Nnt+/+表达单单来血清或NntΔex7-11/Δex7-11表达单单来血清(所示1A-1B)。该数学方法中的Nnt的表达单单来造成了Cre重新组建蛋白酶诱发癌巨噬细胞的节省成本延缓3个年初(所示1C-1D)。然后，运用Kras持续性状与p53紊乱同时表达单单来(LSL-KrasG12D/+；Trp53flox/flox，也称之为KP)建立癌症数学方法。Nnt的表达单单来没有人改变Cre诱发的KP血清的%-(所示1E)。古怪的是，在这个数学方法中的，p53的紊乱消除了Nnt表达单单来对癌症呈现单单的冲击，并且无论Nnt表达单单来如何，实验最终都普遍存在显著的癌巨噬细胞节省成本(所示1F)。癌症节省成本比例的量化在各不相同遗传基因血清之间没有人差异(所示1G-1H)。

虽然各不相同遗传基因血清之间的癌巨噬细胞节省成本没有人差异，但确实判读到数学方法中的癌巨噬细胞摧残持续性的差异。我们发掘单单Nnt+/+血清中的51.3%的癌巨噬细胞为3级(癌)或以上，而NntΔex7-11 / +和NntΔex7-11 /Δex7-11血清中的仅有36.5%和38.8%的癌巨噬细胞是低阶(所示1I)。Nnt+/+血清暴发4级癌巨噬细胞的频率总体增高，断言了癌巨噬细胞摧残持续性的变为(所示1J)。总之，这些数据资料得出结论Nnt增进了癌症的暴发和摧残。

2 NNT的紊乱不冲击叶绿体中的硫氨还抗原(TXN)的抗氨基本概念

为了更进一步检验NNT对癌症生物学的冲击，首先检验shRNA电磁干扰NNT抗原的表达单单来，还包括4个表达单单来NNT抗原的NSCLC巨噬细胞系 (A549, H1299，H2009和PC9)和不表达单单来NNT抗原的H441巨噬细胞(所示2A)。电磁干扰NNT抗原表达单单来减缓NSCLC巨噬细胞的再生并能(所示2B)。并且发掘单单慢免疫缺陷4天后NNT的下调增大了H2009和PC9巨噬细胞的生存并能(所示2C)。此内外，H441巨噬细胞的再生免受NNT的冲击。

通常认为NNT适度NADPH的转化并能，从而可维持叶绿体抗原抗氨系统对保持稳定转化稳定状态(所示2D)。电磁干扰NNT增大了H1299、H2009和PC9巨噬细胞中的NADPH: NADP+的比例 (所示2E)。慢免疫缺陷4天后叶绿体中的H2O2总体增高(所示2F)，所以NNT对H2O2利尿操作过程很最重要。

为了具体这些叶绿体ROS的增高到底与叶绿体抗氨系统对有关，于是运用Western blotting检验叶绿体中的过氨物抗原3(PRDX3)的氨稳定状态。H2O2通过PRDX3利尿，即一对甘氨酸交联诱发PRDX3呈现单单复合物，并且需通过TXN转化这些甘氨酸交联才能转化PRDX3的抗氨机制。PRDX3复合物的积攒是PRDX3氨的图案，是叶绿体氨可不激的常用图案物。

奥拉诺芬是一种TXN转化蛋白酶(TRXR)减缓剂，虽然奥拉诺芬的病人亦会造成了PRDX3抗原大量氨，但NNT的紊乱并没有人增高PRDX3的氨(所示2G)。此内外，NNT的紊乱也没有人增大叶绿体TXN2或TRXR2的抗原水平。总之，这些得单单NNT在NSCLC巨噬细胞再生并能上发挥最重要主导作用，但NNT活持续性的丧失并不想危害叶绿体TXN抗氨系统对，也不想引致显著的氨可不激。

3 NNT的紊乱亦会危害叶绿体的氨并能

鉴于NNT在IMM中的的适配及其冲击膜上和中子辐射能和转化并能，于是试所示探讨NNT对叶绿体氨降解到底最重要。首先，使用海马巨噬细胞内外辐射能温度计顺利完成叶绿体阻力验证，检验NNT紊乱对一般叶绿体氨机制的冲击。结果发掘单单NNT紊乱巨噬细胞的耗氨量(OCR) 随叶绿体减缓剂的依序传递而被降低(所示3A)。或多或少的是，NNT紊乱巨噬细胞的最大排尿并能在不依靠于非电磁排尿的前提总体增大(所示3B)。这提示叶绿体氨理由与NNT对和中子反向的冲击相关联。鉴于NNT紊乱显著冲击排尿并能，于是检查NNT紊乱的H441巨噬细胞到底比NNT表达单单来巨噬细胞具有更少的氨和更极强的腺苷化并能。这解释这些巨噬细胞在没有人NNT的前提似乎通过叶绿体NADPH来源而可维持叶绿体的机制。

叶绿体的氨降解依靠于ETC的机制，ETC由介导Ag的Fe-S抗原复合体组合成。考虑到Fe-S抗原复合体的催化反应反可不操作过程只能NADPH，于是研究者NNT电磁干扰后叶绿体排尿机制的降低到底与Fe-S抗原涉及。叶绿体阻力验证可以对排尿机制顺利完成一般持续性的分析，但不可以对单个ETC复合体化学物质顺利完成检验。因此，写作者顺利完成了更为专业的实验来分析Fe-S抗原依靠的排尿涉及复合体(I, II, III)。结果发掘单单，基于复合体I(丙酮酸和苯甲酸)的消化，在NNT电磁干扰后复合体I-III的活持续性总体增大(所示3C)。此内外，NNT理由巨噬细胞显著增大了水解酶的OCR，得出结论增大了水解酶脱氢蛋白酶(SDH)活持续性和复合体II-III容量(所示3D)。造成了这一物理现象的最重要理由是SDH在ETC和TCA气化中的必不可少双重角色。

除了通过ETC可维持电子容量内外，Fe-S抗原还可维持对氨降解至关最重要的其他抗原蛋白酶的机制。为了具体NNT到底参与其他Fe-S抗原的机制，写作者检验了TCA气化中的Fe-S抗原——顺乌头酸蛋白酶(ACO2)的活持续性。结果发掘单单电磁干扰NNT总体增大了NSCLC巨噬细胞系中的ACO2的活持续性(所示3E)。ACO2活持续性的增大才亦会被毁TCA气化，进而降低动力ETC容量的转化持续性固体的转化。为了足量非小巨噬细胞癌症中的ACO2机制的分析，于是评分Nnt表达单单来对KP癌症中的ACO2活持续性的冲击。得单单，Nnt+/+血清癌巨噬细胞中的Aco2活持续性显著优于NntΔex7-11/+ 和NntΔex7-11/Δex7-11中的的，缺失Nnt的癌巨噬细胞体现单单最低的活持续性(所示3F)。

4 内经年累月持续性NADPH在NNT紊乱后可维持Fe-S抗原机制

为了具体与电磁干扰NNT涉及的叶绿体Fe-S抗原机制的增大到底与NADPH:NADP+的增大有关，我们试所示还包括一种叶绿体NADPH的内经年累月持续性来源。为了做到这一目标，我们并不需要了菌种叶绿体中的NADH激蛋白酶pos5p，它可以腺苷化NADH而造成了NADPH。虽然pos5p以前在细菌中的也有内经年累月表达单单来，但据我们所知，pos5p还没有人被引入灵长类系统对。为了检查我们到底只能有效在人类NSCLC巨噬细胞的叶绿体中的表达单单来pos5p抗原，我们对菌种抗原顺利完成了修饰，使其涉及联HA-tag。Western blot得单单，在H1299、H2009和PC9巨噬细胞的叶绿体中的急于表达单单来了HA-tag标记的pos5p抗原(所示4A)。并不需要这些巨噬细胞系是为了检验pos5p整修和NNT紊乱涉及的Fe-S抗原理由的并能，发掘单单电磁干扰NNT后对它们造成很严重的冲击。

pos5p的表达单单来挽回了巨噬细胞中的电磁干扰NNT后引致的NADPH: NADP+比例的降低(所示4B)。这与表达单单来pos5p巨噬细胞中的pos5p被电磁干扰后排尿支链适合于活动的降低有关(所示4C和4D)。此内外，pos5p的表达单单来实际上挽回了NNT电磁干扰后ACO2活持续性的降低(所示4E)。总之，这些数据资料得出结论可维持NNT表达单单来紊乱时NADPH的水平可以保护NSCLC巨噬细胞中的Fe-S抗原的机制。

5 NNT的紊乱不想被毁Fe-S抗原的催化反应反可不

考虑到叶绿体内经年累月持续性NADPH只能弱化NNT紊乱涉及Fe-S抗原的理由，并且NADPH是高效可维持Fe-S抗原催化反应反可不的必备条件，因此我们再一试所示具体NNT活持续性到底可维持这一操作过程。Fe-S抗原催化反应反可不暴发在一个由甘氨酸高炉蛋白酶(NFS1)和Fe-S支架抗原(ISCU)组合成的多抗原复合体中的。复合体中的任何一种化学物质的紊乱都亦会冲击催化反应反可不，并且也与叶绿体理由涉及。因此，我们电磁干扰NFS1或ISCU表达单单来来研究者被毁Fe-S抗原催化反应反可不后对排尿支链和ACO2的冲击。

在H2009巨噬细胞中的，电磁干扰NFS1后总体增大丙酮酸/苯甲酸反可不和水解酶反可不中的排尿支链复合体I-III的活持续性，而在PC9巨噬细胞中的只有复合体II-III活持续性被显著增大(所示5A和5B)。另内外，两个巨噬细胞系中的，在丙酮酸/苯甲酸和水解酶的主导作用下，电磁干扰ISCU表达单单来后总体弱化了OCR(所示5A和5B)。并且电磁干扰NFS1或ISCU后总体增大了巨噬细胞系中的ACO2活持续性(所示5C)。古怪的是，NNT电磁干扰后所引致的理由与Fe-S抗原催化反应反可不所需固体造成的理由是同等最重要的(所示5A-5C)。

为了断言Fe-S抗原理由对NSCLC巨噬细胞的叶绿体降解有机制持续性冲击，我们对电磁干扰NNT或ISCU巨噬细胞顺利完成基于相态气相-高分辨质谱(LC-HRMS)的降解组学研究者。 对这些巨噬细胞TCA气化的降解物顺利完化学物质析，得单单大多数中的间游离的丰度暴发了总体变为(所示5D)。这些都得出结论了氨降解的严重被毁和Fe-S抗原机制理由的相容持续性。具体地说就是电磁干扰NNT和ISCU表达单单来后，丙酮酸、苯甲酸和富马酸被耗用。NNT紊乱巨噬细胞中的的过氧化氢水平被耗竭，但电磁干扰ISCU巨噬细胞中的并没有人此结果。另内外，电磁干扰ISCU巨噬细胞中的水解酶大量积攒，而在NNT紊乱巨噬细胞中的则不普遍存在此物理现象(所示5D)。

除了Fe-S抗原ACO2和SDH内外，TCA气化还依靠于另一种叶绿体Fe-S抗原——SAM酸裂解蛋白酶(LIAS)的机制。LIAS对于SAM酸的裂解以及最重要SAM酸食盐羟基的芳基都并不最重要，SAM酸食盐羟基由PDH (E2)和α-酮芳基脱氢蛋白酶(二氢SAM乙基胺S-琥珀乙基转移蛋白酶，DLST)组合成。LIAS对Fe-S抗原催化反应反可不的被毁除此以内外引人注意，因为其Fe-S簇在催化反应操作过程中的被耗用掉，这就要求不断地顺利完成抗原互换。事实上，电磁干扰NFS1和ISCU表达单单来亦会大量降低PC9巨噬细胞中的PDH-E2和DLST的脂化，然而电磁干扰NNT对抗原脂化无冲击(所示5E)。总的来说，这些数据资料得出结论，NNT造成了蛋白酶和降解理由，它们的理由与Fe-S抗原催化反应反可不的被毁涉及，但NNT不似乎直接冲击这一操作过程。这反映单单电磁干扰NNT和ISCU后对TCA气化造成了实际上相同但又各不相同的冲击。

6 NNT的紊乱被毁胺基酸降解

除了耗用TCA气化中的间体内外，NNT理由巨噬细胞的LC-HRMS降解组学分析得出结论胺基酸降解失调。电磁干扰NNT增进长支链糖类乙基基甲壳素的大量积攒，而长支链糖类乙基基甲壳素是胺基酸β-氨的底物(所示6A)。鉴于在NNT理由巨噬细胞中的普遍存在排尿系统对理由，我们得出结论这些乙基基甲壳素的增高是由于胺基酸氨降低。我们发掘单单在H1299和PC9巨噬细胞中的OCR与橄榄酸食盐的氨有关，电磁干扰NNT后OCR增大(所示6B)。我们还判读到NNT理由巨噬细胞中的糖类和三酸甘油酯原则上大量积攒(所示6C)。胺基酸裂解只能耗用大量NADPH，而且NNT电磁干扰后NADPH的有效持续性增大，于是我们认为这些胺基酸水平的增高是由于内经年累月持续性胺基酸摄入的增高。另内外，我们发掘单单，NNT理由巨噬细胞弱化了对荧光橄榄酸实际上相同物的吸收并能(所示6D)。为了评分NNT电磁干扰后胺基酸的积攒到底是一个潜在的主因，我们使用糖类橄榄酸酯激发NNT理由巨噬细胞24不间断，发掘单单NNT电磁干扰后使H1299和H2009巨噬细胞对橄榄酸食盐引人注意(所示6E)。此内外，NNT电磁干扰后总体大幅提高了H1299和PC9巨噬细胞对单一三酸甘油酯油酸食盐的引人注意持续性(所示6F)。鉴于内经年累月持续性胺基酸足量的有毒冲击，我们预计巨噬细胞内外钙耗用将保护NNT的紊乱。难以置信困惑的是，培养基中的的钙耗用日益严重了NNT的下调(所示6G)。更最重要的是，NNT电磁干扰后巨噬细胞内外钙缺少亦会增高NADPH的耗用(所示6H)，这得出结论在缺失内经年累月持续性胺基酸的前提被迫裂解胺基酸，使NNT理由巨噬细胞中的NADPH的有效持续性增大。总的来说，这些数据资料得出结论NNT似乎在减缓胺基酸降解中的起最重要主导作用，NSCLC巨噬细胞的胺基酸降解紊乱似乎是一个可运用的弱点。

7 NNT紊乱后叶绿体特异持续性甲酸蛋白酶(MitoCatalase)挽回Fe-S抗原机制

Fe-S抗原对分子氨和更多有毒固体的氨并不引人注意。虽然我们没有人判读到叶绿体抗原抗氨系统对的氨稳定状态暴发变为，但这并不忽略NNT电磁干扰后造成了的叶绿体ROS足够将这些引人注意持续性辅因子氨。为了探究这种似乎持续性，我们使用了叶绿体特异持续性的甲酸蛋白酶(MitoCatalase)来弱化叶绿体的抗氨并能。我们急于地在H1299、H2009和PC9巨噬细胞中的过表达单单来了MitoCatalase (所示7A)。MitoCatalase的表达单单来也大部分弱化了NNT电磁干扰后涉及叶绿体中的H2O2的造成了(所示7B)。这与NNT电磁干扰后排尿支链适合于活动的降低相对可不(所示7C和7D)。另内外，MitoCatalase的表达单单来实际上恢复NNT电磁干扰后ACO2的活持续性(所示7E)。综上所述，这些数据资料得出结论，大幅提高叶绿体利尿H2O2的并能可以防止NNT电磁干扰后Fe-S抗原暴发理由，从而使NNT在防止Fe-S抗原暴发氨方面发挥主导作用，但对Fe-S簇的催化反应反可不无主导作用。

论点

总之，我们的研究者得出结论，NNT对癌症生物学具有最重要意义，主要是通过转录Fe-S抗原而增进叶绿体降解。与基本上评分NNT机制的研究者各不相同，我们描述了NNT对NSCLC中的叶绿体氨转化周期性的微妙冲击。在NSCLC中的，NNT活持续性似乎减轻了大量氨降解引致的氨可不激反可不。我们的发掘单单更进一步得出结论了叶绿体降解在癌症暴发中的的必要持续性，解释叶绿体机制的弱化似乎是癌症病人的一个最重要各种因素。蛋白酶TPH-1对消化道保护起最重要主导作用，似乎作为病人CKD的潜在病人各种因素。

更早单单处：

Ward NP, Kang YP, Falzone A, Boyle TA, DeNicola GM. Nicotinamide nucleotide transhydrogenase regulates mitochondrial metabolism in NSCLC through maintenance of Fe-S protein function.J Exp Med (IF: 10.892). 2020 Jun 1;217(6):e20191689. doi: 10.1084/jem.20191689.